厭氧培養箱的使用需嚴格按照標準操作流程進行，以確保箱內維持穩定、可靠的無氧環境，保障厭氧微生物的正常培養。以下是系統化的操作步驟與關鍵注意事項：

一、操作前準備

環境檢查?

確保設備放置平穩，周圍通風良好，避免強電磁干擾。檢查電源連接正常，氣源（氮氣、氫氣、二氧化碳混合氣）壓力充足（通?！?MPa），氣體純度≥99.99%。

耗材與配件準備?

準備鈀粒（約1000g）和干燥劑（約500g）用于除氧與控濕

放入美蘭或刃天青等厭氧指示劑監測氧氣殘留

檢查手套密封性，準備好無菌培養皿、預還原培養基等實驗器具

氣密性檢測?

關閉所有艙門，啟動真空泵抽至0.08 MPa，關閉閥門后觀察5分鐘，壓力變化應≤0.01 MPa，否則需用肥皂水排查漏點。

二、厭氧環境建立流程

氮氣置換（3次循環）?

充入氮氣使操作室手套鼓起，隨后抽真空至66 kPa以上

重復該過程3次，逐步降低氧氣濃度

混合氣體置換（2–3次）?

切換至混合氣體（N? 85%、H? 10%、CO? 5%）

以每分鐘10 ml左右的流量通入，配合抽真空完成2–3次循環

最后一次置換使用混合氣，確保取樣室無氧殘留

催化除氧?

打開鈀粒除氧劑電源，利用鈀催化劑將殘余氧氣與氫氣反應生成水，實現深度除氧。1小時后觀察美蘭指示劑，若不變色（無氧狀態）則達標。

紫外線滅菌?

關閉操作室，開啟紫外燈照射30分鐘，對內腔進行滅菌處理。

三、樣品轉移與培養

樣品傳入操作室?

打開取樣室外門，放入菌種后關閉

對取樣室執行3次“抽真空→充氮氣"置換，最后一次充入混合氣體

檢查壓力平衡后打開內門，將樣品移入主操作室

設置培養參數?

根據實驗需求設定溫度（通常為35–37℃）和濕度（建議45%–60%）

溫度可任意調節并保持恒定

日常監控?

每日觀察美蘭指示劑顏色，異常時需重新置換氣體

長期運行需持續補入微量混合氣體（約10 ml/min），抵消微量氧滲透

四、使用后處理與維護

清潔消毒?

使用75%乙醇或專用消毒劑擦拭內壁、手套袖套及傳遞艙，防止污染。

耗材更換?

每連續運行一天更換一次鈀粒與干燥劑

鈀催化劑每3–6個月再生或更換（160℃烘烤2小時可活化）

氣體與電源管理?

實驗結束后關閉氣瓶閥門，排空管路余氣；長期不用時每周開機一次維持干燥。